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β-细辛醚脂质立方液晶纳米粒的Bottom-up法制备工艺优化及处方挑选

发布时间:2022-01-13 06:36:01 来源:凯发k8官方网站    

  β-asarone lipid cubic liquid crystal nanoparticles的包封率、载药量、安稳性常数的归一化归纳评分为质量调查目标,别离经过单要素调查立方液晶制备工艺,优化工艺参数,并经过星点规划呼应面法,优选

  立方液晶纳米粒(cubicliquid crystalline nanoparticles,LCNPs),又称脂质立方液晶纳米粒或纳米立方体,是两亲性脂质和表面活性剂在水中自发构成的双接连的立方液晶纳米涣散体系,即脂质和表面活性剂结合水构成立方液晶相[1-2],再以相似固体纳米粒的方式涣散在过量的水中构成涣散体系,是一种新式纳米载药体系,其间水溶性药物能够包封在类脂立方液晶的水道中,脂溶性的药物包封在脂质双分子层中,两亲性分子可贯穿其间[3-4]。立方液晶介于层状液晶、六角液晶之间的一种相态,具有更好的热力学安稳性、生物黏附性、生物可降解性、多样性包载药物才能等特色[5],作为新式纳米载药体系在化学药、生物药、中药范畴都有广泛使用研讨,已成为国内外制剂研讨的热门之一[6-8]。

  LCNPs制备办法有Top-down法、Bottom-up法、热处理法、注入法、喷雾枯燥法等。上述办法中,Bottom-up法是现在制备LCNPs常用的办法[9]。Bottom-up法是将脂质资料和安稳剂溶于有机溶剂中得到有机相,然后将有机相缓慢滴加到过量水相中,在拌和、超声等外界机械力涣散效果下即可构成纳米级粒子[10]。Bottom-up法更简单在较小能量输出条件下产生粒子均匀、粒径较小的LCNPs。Bottom-up法制备纳米粒过程中因安稳剂参加,纳米粒涣散体有较好的安稳性[11-12]。

  β-细辛醚为天南星科菖蒲属植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott有用成分,药理研讨标明β-细辛醚药理效果广泛,具有维护神经体系、维护心血管、抗哮喘、抗肿瘤、驱虫等成效,具有极大的临床运用价值[13-14],但β-细辛醚水溶性差,不安稳,且体内吸收、代谢速度极快,药物浓度崎岖大,难以坚持满足长的有用血药浓度,生物利费用低,限制了药物的临床使用[15]。选用新剂型改善药物,是处理药物存在问题的有用办法。本试验选取β-细辛醚为模型药物,选用Bottom-up法优化β-细辛醚脂质立方液晶纳米粒(β-asarone lipid cubic liquid crystal nanoparticles,β-A@LCNPs)的制备工艺,并经过星点规划呼应面法挑选β-A@LCNPs处方。

  丹东百特BT-90纳米激光粒度仪,丹东百特仪器有限公司;Agilent 1200型高效液相色谱仪,包含四元泵洗脱体系、自动进样器、在线脱气装置、柱温箱及光电二极管矩阵检测器,美国Agilent公司;VORTEX 4涡旋振荡器,上海达姆实业有限公司;DDS-307A电导率仪,上海仪电科学仪器公司;G220透射电子显微镜(TEM),荷兰FEI公司;TG16.5离心机,上海卢湘仪离心机公司;KQ-50TDB高频数控超声仪,昆山超声仪器公司;TK-12B型透皮涣散仪,上海凯锴科贸有限公司。

  选用Bottom-up法制备β-A@LCNPs,精细称取适量GMO于50 mL烧杯中,取处方量β-细辛醚滴加无水乙醇至彻底溶解,倒入上述烧杯中混匀,水浴至60℃,作为A相;精细称取适量PVA于100 mL烧杯中,参加适量蒸馏水,水浴至60℃,使PVA彻底溶解,作为B相;将A相缓慢倒入B相中,60℃恒温条件下,以800r/min磁粒拌和1.5 h,再于细胞超声破碎仪上超声5 min(超声功率为150 W,5 s/次,每次距离5 s),即得β-A@LCNPs。

  2.2.2对照品溶液制备精细称取β-细辛醚对照品适量,至棕色量瓶中,加甲醇定容,制成β-细辛醚浓度为32.27µg/mL的溶液,过0.45 µm微孔滤膜,取续滤液,即得。

  2.2.3供试品溶液制备精细汲取β-A@LCNPs悬浊液样品1 mL至10 mL棕色量瓶中,加甲醇定容,过0.45 µm微孔滤膜,取续滤液,即得。

  2.2.4线性联系调查精细汲取β-细辛醚对照品溶液1、2、4、6、8 mL,别离置于10 mL量瓶中,加甲醇至刻度摇匀,备用。精细汲取上述对照品溶液各10 μL,进样,记载色谱图,测定峰面积,以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归,得回归方程Y=72 859.93 X-560.6,r=0.999 99,成果标明β-细辛醚在32.27~258.16 ng,峰面积与进样量呈杰出线

  精细汲取上述对照品溶液各10 μL,按“2.2.1”项色谱条件,重复进样6次。成果β-细辛醚峰面积的RSD为0.15%,标明仪器精细度杰出。2.2.6

  别离于制备后0、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0 h精细汲取10 μL供试品溶液进样测定,成果β-细辛醚峰面积的RSD为1.23%,标明供试品溶液在12 h内测定安稳性杰出。2.2.7

  别离取6份β-A@LCNPs悬浊液样品,照“2.2.3”项办法制得6份供试品溶液,照“2.2.1”项色谱条件别离进样10 μL进行测定,成果β-细辛醚质量分数的RSD为0.93%,标明该办法重复性杰出。2.2.8

  精细量取1 mL已测定β-细辛醚含量的β-A@LCNPs悬浊液至10 mL棕色量瓶中,共6份,别离参加2 mL已知质量浓度的对照品溶液,照“2.2.3”项办法制备供试品溶液,按“2.2.1”项色谱条件测定β-细辛醚含量,核算回收率,成果β-细辛醚的均匀加样回收率为99.81%,RSD为0.75%,标明本办法β-细辛醚具有较好的加样回收率。2.2.9

  按“2.2.3”项办法制备供试品进样液,依照“2.2.1”项色谱条件进样,测定β-细辛醚峰面积,代入线性方程,核算出样品中β-细辛醚的含量。2.3

  称取必定量β-细辛醚(Wtd),按“2.1”项办法制备得β-A@LCNPs溶液,将β-A@LCNPs溶液选用高速离心法,13 485×g离心10 min,别离得到上清液和β-A@LCNPs沉积。汲取上清液,依照“2.2.1”项色谱条件检测剖析上清液中游离的β-细辛醚含量,测定游离β-细辛醚质量(Wfd);取基层沉积,选用冷冻枯燥法将其枯燥得β-A@LCNPs,并精细称定,得纳米粒总质量(WLCNPs)。根据公式(1)、(2)别离核算β-A@LCNPs包封率和载药量。包封率=

  K e)的测定选用离心-可见光分光光度法测定β-A@LCNPs的K e。详细测定办法为量取β-A@LCNPs,检测波长450 nm,选用可见光分光光度法测定其浊度为T0;900×g离心30 min,汲取上层液,可见光分光光度法同波长测定离心后上层液的浊度为T,根据公式(3)核算K e。K

  D)核算[16]归纳考量β-A@LCNPs的包封率、载药量及K e值,作为制剂质量点评要素,因此选用Derringer’s法将包封率、载药量和K e转换为D值。根据Hassan法别离求Partial期望值(d i),其间包封率及载药量值越大,标明β-A@LCNPs质量越好,而K e值越小,则阐明β-A@LCNPs质量越好,根据公式(4)别离将包封率及载药量归一化为Partial期望值,记为d 1、d 2;根据公式(5)将K e归一化为Partial期望值,记为d 3,再根据公式(6)将d 1、d 2、d 3转化为D值。d xi

  β-A@ LCNPs,以载药量、包封率及K e的D值为β-A@ LCNPs质量点评目标,坚持其他条件平等,调查单个要素改动对D值的影响,初选工艺及处方。2.4.1

  选用Bottom-up法制备β-A@LCNPs,取β-细辛醚20 mg滴加无水乙醇至彻底溶解,参加装有0.20 g GMO的烧杯中,水浴至60℃,作为A相;称取20 mg PVA参加装有40 mL蒸馏水中水浴至60℃,使PVA彻底溶解,作为B相;将A相缓慢倒入B相中,重复上述操作,平行制备5份样品,备用;60℃恒温条件下,以1000 r/min匀速拌和,别离拌和0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,调查不同拌和时刻对制备β-A@LCNPs D值的影响。测定各样品包封率、载药量、K e值,并核算D值,成果见表1。可知,拌和时刻在1.5 h内,跟着拌和时刻添加,β-A@LCNPs的D值添加,当拌和时刻超越1.5 h,β-A@LCNPs的D值反而呈下降趋势,这或许因为拌和时刻过长,拌和剪切力损坏已构成纳米粒的体系结构,致使药物溶出,载药量及包封率下降,因此,挑选拌和时刻1.5 h。

  参照“2.3.1”项办法平行装备5份β-A@LCNPs悬浊液,60℃恒温条件下,别离以500、800、1000、1200、1500 r/min不同拌和速度,拌和1.5 h,调查不同拌和速度对制备β-A@LCNPs D值的影响。测定各样品包封率、载药量、K e值,并核算D值,成果见表2。可知,拌和速度在1000 r/min内,跟着拌和速度添加,β-A@LCNPs的D值添加,当拌和速度超越1000r/min时,β-A@LCNPs的D值反而呈下降趋势,这或许因为拌和速度小,纳米粒子不简单涣散开,易沉;而速度过快,纳米粒子间磕碰加重,粒子集合而分出,D值较小,因此,挑选拌和速度1000 r/min。

  参照“2.3.1”项办法平行装备5份β-A@LCNPs悬浊液,60℃恒温条件下,1000 r/min转速,匀速拌和1.5 h,然后别离置于细胞超声仪,别离以100、150、200、250、300 W超声处理10次,每次5 s,距离10 s,测定各样品包封率、载药量、K e,并核算D值,成果见表3。可知,超声功率对样品的D值影响较大,当超声功率>200 W时,跟着超声功率的添加,包封率及载药量下降,D值减小,这或许因为超声功率过大对纳米粒子结构形成损坏,因此确认超声功率为200W。

  参照“2.3.1”项办法平行装备5份β-A@LCNPs悬浊液,60℃恒温条件下,1000 r/min转速,匀速拌和1.5 h,然后别离置于细胞超声仪,设定超声功率为200 W,别离超声5、10、15、20、25次,每次5 s,距离10 s,测定各样品包封率、载药量、K e,并核算D值,成果见表4。可知,当超声次数超越15次时,β-A@LCNPs的D值减小,阐明超声次数过多导致晶型产生改动,药物渗漏,包封率下降,载药量下降。所以,归纳考虑挑选超声次数为15次。

  参照“2.3.1”项办法平行装备GMO量别离为0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g,其他各量平等(PVA 20 mg、β-细辛醚20 mg、水40 mL)β-A@LCNPs悬浊液,60℃恒温条件下,1000 r/min转速,匀速拌和1.5 h,然后置细胞超声仪,200 W,超声15次,每次5 s,距离10 s,测定各样品包封率、载药量、K e值,并核算D值,成果见表5。可知,GMO参加量对该载药体系的D值具有显着影响,当GMO用量为0.25 g时,D值最大,这与GMO用量对纳米粒子结构安稳有关,需进一步优选用量。

  坚持其他条件平等(GMO 0.25 g、PVA 20 mg、水40 mL),别离装备不同投药量(10、15、20、25、30 mg),平等制备工艺(参照“2.3.5”项),制备β-A@LCNPs,别离测定各样品包封率、载药量、K e值,并核算D值,成果见表6。可知,投药量<20 mg,跟着投药量添加D值增大,当投药量>20 mg,跟着投药量添加D值减小,阐明投药量对β-A@LCNPs制备的D值有较大影响,需做进一步调查优化。

  坚持其它条件平等(GMO 0.25 g、β-细辛醚20 mg、水40 mL),别离称取你20 mg不同安稳剂(F127、PVA150、PVA),平等制备工艺(参照“2.3.5”项),制备β-A@LCNPs,别离测定各样品包封率、载药量、K e值,并核算D值,成果见表7。可知,PVA作安稳剂时,包封率、载药量、K e及D值最大,故挑选PVA作为β-细辛醚LCNPs载药体系安稳剂。

  PVA用量调查坚持其他条件平等(GMO 0.25 g、β-细辛醚20 mg、水40 mL),别离称取不同剂量PVA(10、15、20、25、30 mg),平等制备工艺(参照“2.3.5”项),制备β-A@LCNPs,别离测定各样品包封率、载药量、K e值,并核算D值,成果见表8。可知,投药量<20 mg,跟着投药量添加D值增大,当投药量>20 mg,跟着投药量添加D值减小,阐明阐明PVA在必定规模内能够参加脂质立方液晶结构的拼装并能支撑整个骨架,可是当用量超越20 mg,其又或许会导致结构的损坏或许晶型结构的改变,导致包封率、载药量、K e及D值下降,需做进一步调查优化。

  坚持其它条件平等(GMO 0.25 g、PVA 20 mg、β-细辛醚20 mg),别离量取不同体积涣散水相(20、30、40、50、60 mL),平等制备工艺(参照“2.3.5”项),制备β-A@LCNPs,别离测定各样品包封率、载药量、K e值,并核算D值,成果见表9。可知,跟着水相体积添加,该递释体系D值添加,当水相体积>30 mL时,D值简直不变。原因或许当水含量少,β-A@LCNPs的浓度大,纳米粒易彼此黏合,药物易分出;水相体积大,纳米粒能较好的涣散,不集合,载药量、包封率较高,K e较小,D值变大。考虑该载药体系的药物浓度,需对水相用量进一步优选。

  β-细辛醚量、PVA量及水相对β-A@LCNPs质量归纳评分影响较大,并选用星点规划呼应面法对β-A@LCNPs处方进一步优化。2.5.1

  选取GMO量(X1)、β-细辛醚量(X2)、PVA量(X3)、水相(X4)4个要素作为自变量,每个要素设5水平,用代码值− α、−1、0、+1、+ α来标明(4要素星点规划的α=1.682)。代码值所代表的实践操作物理量见要素水平表10。别离测定各试验样品的包封率、载药量和K e,参照“2.2.3”项下办法,核算D值,作为β-A@LCNPs归纳点评调查目标,选用星点规划优化处方,试验组织及成果见表10。

  、X12、X22、X32及X42项为4要素对目标的独自效果,而X1X2、X2X3、X1X3、X2X4、X1X4和X3X4项为要素的交互效果,方程从全体上反映了各要素及其彼此效果对目标值的影响。2.5.3方差剖析选用ANOVA剖析呼应面的回归参数。表11中统计剖析数据显现给出了线性项、二次项、以及交互项对各调查目标归纳得分的影响,其间GMO量(X1

  PVA量(X3),对呼应值(归纳评分D值)的曲面效应明显(P<0.05);GMO量(X1)与PVA量(X3)的交互项(X1X3)、水量的二次项(X42)对呼应值(D值)的曲面效应极明显(P<0.01);在所选取的各要素水平规模内,依照对呼应值(D值)的影响排序:PVA量(X3)>GMO量(X1)>水(X4)>β-细辛醚(X2)。二项式回归方程失拟查验不明显,阐明不知道要素对试验成果搅扰很小。拟合查验极明显,阐明该方程与实践情况拟合很好,较好地反响了β-A@LCNPs归纳得分(D值)与GMO、β-细辛醚、PVA、水不同配方用量的联系,能够对条件规模内不同配方的β-A@LCNPs进行质量点评(归纳评分D值)进行猜测。2.5.4呼应面优化、猜测与验证根据二次多项式模型,使用Design-Expert 8.0.5b软件制作各调查目标归纳得分与各自变量间的三维呼应曲面图及等高线。

  结合二次回归模型进行猜测剖析,β-A@LCNPs D值最大值为0.745 5,此刻最优处方GMO 300 mg、β-细辛醚

  PVA 25 mg、水40 mL。按最优处方,制造3份β-A@LCNPs,对每份样品进行质量归纳点评得分进行试验验证,成果β-A@LCNPs包封率均匀值为90.78%、载药量均匀值为5.31%、K e均匀值为

  ,D值均匀为0.72,实践值与猜测值比较误差率为−2.91%,RSD为1.36%,标明所树立的数学模型具有杰出的猜测性,所选处方重现性好,工艺安稳。2.6β-A@LCNPs粒径散布测验按β-A@LCNPs最优处方及工艺平行制备3份样品,用蒸馏水稀释10倍,别离测定其粒径散布,成果显现,

  )为0.190±0.003。2.7β-A@LCNPs TEM调查按β-A@LCNPs最优处方及工艺制备β-A@ LCNPs样品,稀释100倍,滴在样品台上,放置于枯燥皿中天然枯燥。样品枯燥后放入离子溅射仪中镀金膜,再将样品置于透射电镜中调查

  在水中涣散较好,且粒径巨细差异较小。经过扩大电镜倍数发现,β-A@LCNPs为立方体结构,外观完好,且存在空间结构堆积。2.8体外经皮浸透调查别离制造相同药物浓度(载药量5.31%)的β-A@LCNPs(按最优处方与制备工艺制备)与β-

  )进行体外经皮浸透调查。取β-A@LCNPs和β-细辛醚乳液各5 mL,别离参加Franz涣散池[20],浸透膜为小鼠腹部脱毛全皮,所用鼠皮的厚度均一,有用涣散面积为4.50cm2,接纳池体积为

  ,接纳介质为32℃生理盐水,200 r/min匀速磁力拌和,以β-细辛醚为调查目标,别离于1、2、4、6、8、10、12 h抽取5 mL接纳液(一起补加5 mL空白接纳液),过0.45μm微孔,参照“2.2.1”项下办法,测定接纳液中β-细辛醚含量,以上试验,β-A@LCNPs和一般乳别离平行做3组试验,取均值,制作浸透曲线,拟合参数,得药物体外经皮浸透动力学曲线,经过比较体外经皮浸透动力学参数稳态透皮速率(Js)和单位面积累积浸透量(Qn),能够看出β-A@LCNPs较β-细辛醚乳液透皮速率提高了3倍,制剂透皮功能得到明显提高。Q n=C n/ AJs=

  时刻药物的测定质量浓度,Cps为t时前药物的测定质量浓度,V0为每次取样体积,V为接纳液的总体积,Qn为t时刻单位面积累积浸透量,A为有用涣散面积3讨论本研讨选用Bottom-up法将模型药物β-细辛醚制备为LCNPs

  β-A@LCNPs制备工艺进行调查优化,建立最佳制备工艺。并在单要素调查处方剂量对β-A@LCNPs质量影响的基础上,选用星点规划呼应面法,以β-A@LCNPs各组分为调查要素,结合Design-Expert 4

  5水平规划组织试验,以β-A@LCNPs质量归纳评分(D值)为点评目标,优选出最佳β-A@LCNPs处方,优选的β-A@LCNPs制备工艺、处方安稳可行。现在国内多选用制作三元相图液晶区挑选立方液晶处方,但往往存在可挑选区域规模广,调查目标相对片面,终究建立的处方多是预设的调查参数优选,无法动态接连挑选目标,精确度不高。本试验LCNPs最佳处方挑选,在单要素调查目标参数规模的基础上,选用星点规划呼应面法,各要素对效应的影响并非线性,且考虑到多要素间的交互效果,差异于线性规划的正交规划或均匀规划挑选处方,星点规划经过屡次试验成果参数进行模型拟合优化,找到拟合度最佳方程,目标参数具有接连性,多元高次方程归纳考量单要素及要素间的协同效应,推算出最佳配方,验证及重复性好,工艺安稳。星点规划呼应面法挑选立方液晶处方,猜测指导性更强,具有较好的推广使用价值,为β-A@LCNPs制备工艺供给了科学、合理的理论和试验根据。立方液晶载药体系制备办法有热融法、喷雾枯燥法、Top-down法、

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